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间变性淋巴瘤激酶（ALK）是已被证实的非小细胞肺癌（NSCLC）分子靶点之一。对于晚期ALK融合阳性NSCLC患者，ALK-TKI是首选的治疗方案，可以显著延长患者的生存。

然而，在靶向药的治疗过程中，肿瘤细胞不可避免会发生克隆演化并导致耐药。其中，神经内分泌（Neuroendocrine, NE）转化是耐药原因之一^[1]。目前，NE转化的研究主要集中于EGFR突变的肺腺癌，对于ALK融合阳性肺腺癌NE转化的机理目前仍然缺乏系统性研究。

广东省人民医院、广东省肺癌研究所杨衿记教授（通讯作者）研究团队发表了一项研究，通过基因组和转录组学的分析，探究1例ALK融合阳性的肺腺癌治疗后转化为神经内分泌癌的分子机理，揭示ALK-TKI耐药的潜在作用机制。

病例介绍

患者女性，58岁，无吸烟史，于2018年5月被诊断为IVB期肺癌，伴有双肺、骨和肝转移。左侧锁骨上淋巴结活检（标本T1）的病理结果提示腺癌，免疫组化（D5F3克隆）提示为ALK蛋白阳性。NGS基因测序显示为ALK与SYNE1非经典融合（图2A）。

患者一线接受克唑替尼治疗，疗效部分缓解（PR），无进展生存期（PFS）仅为6个月。进展后患者接受了肺部活检（标本T2），检测到原有ALK融合，但没有检测到克唑替尼耐药突变。患者继续使用克唑替尼，但2个月后出现头晕头痛的症状，MRI显示出现脑转移。

患者拒绝更换治疗方案，因此继续使用克唑替尼治疗。3个月后患者再次出现疾病进展，行腰椎穿刺收集到脑脊液，脑脊液中没有发现肿瘤细胞，NGS液体活检发现ALK-SYNE1融合。由于该患者的心电图结果显示QTcF超过470毫秒，SAF-189s的临床试验入组筛选失败，随后她接受了SAF-189s的同情给药治疗，PFS接近8个月。

肿瘤发生进展后，患者未进行再次活检，接受了阿来替尼治疗，疗效为疾病稳定（SD）持续约5个月。随后患者发生所有已知病灶进展，且肿瘤标志物NSE显著上升。患者再次接受了右侧锁骨上淋巴结活检（标本T3），病理提示为小细胞肺癌（SCLC）和大细胞内分泌癌（占比分别为30%和70%），免疫组化提示ALK阳性，PD-L1阴性。

T3 NGS结果检出了原始的ALK融合，并检出了之前样本未检测出的新突变。患者随后接受卡铂/依托泊苷治疗，并继续使用阿来替尼，颅内和颅外病灶均部分缓解。8个月后患者出现昏迷，MRI提示严重颅内进展，脑脊液中检出可疑肿瘤细胞，脑脊液NGS检测结果为最初的ALK融合和新的基因突变。

患者随后使用洛拉替尼治疗约1个月，但疾病迅速恶化，最终在检测到NE转化后的11个月后去世。

图1 病例的临床病史

NE转化前后的基因组分析

为了深入研究NE转化前后的基因变化，我们利用WES对T1、T2和T3样本进行测序。三个样本检测出共有突变，提示他们在克隆演化上是相关的。相对T1和T3，T2拥有的共有突变和拷贝数变异更少（图2B和2C），可能为组织间的异质性所致。

RB1/TP53突变在转化前后均未检测到，T3样本中检测到CDK4扩增、CDKN2A缺失和CDKN2B缺失（图2C），提示CDK4可能是潜在的治疗靶点。此外，肿瘤新抗原负荷在NE转化后显著更高（图2D）。

克隆演化分析表明ALK-SYNE1融合在基线诊断时就存在，并持续存在于NE转化过程中；克隆演化过程中未出现获得性ALK耐药突变，但经ALK-TKI治疗后出现了RHOA和RHPN2突变的亚克隆（图2E）。

NE转化后，活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（AID）/催化多肽样载脂蛋白B mRNA编辑酶（APOBEC）的高突变特征未见明显变化（signature 2），但错配修复相关突变特征（signature 15）显著增加（图2F）。

图2 NE转化的基因组特征

（A）NGS检测的ALK-SYNE1融合（B）WES检出的基因突变谱和T1、T2、T3共有突变的韦恩图（C）肿瘤基因的拷贝数变异（D）预测的肿瘤新抗原负荷（E）此病例中ALK抑制剂耐药的克隆演化（F）基于96个三碱基类型的突变谱和每个特征的相对贡献值绘图

NE转化前后的转录组分析

我们通过RNA测序分析T1和T3基因表达谱的差异，结果表明T3相对T1，其Notch和PI3K/AKT信号通路的基因显著上调，而与淋巴细胞活化和NF-kB信号通路相关的基因显著下调（图3A）。基因富集分析显示，与同源重组、MMR和Notch信号通路相关的基因在T3中显著富集（图3B），这一结果也与TCGA数据库中的结果一致。

此外，T3富集的生物学过程包括DNA复制、细胞周期和神经元投射发育，而T1相关的生物学过程主要包括适应性免疫反应，淋巴细胞活化和补体活化（图3C）。

由于差异表达基因和富集通路都与免疫应答相关，我们进一步使用CIBERSORT对转录组数据进行了免疫反褶积分析，结果发现T1有更高水平的CD8 T细胞浸润和NK细胞激活，而T3有更显著的M2巨噬细胞浸润，这一结果在TCGA数据库中得到进一步证实。这一结果也提示在NE转化过程中肿瘤免疫微环境由活跃向抑制转变。

图3 NE转化的转录组特征

（A）T1和T3的差异表达基因火山图（B）T1和T3的差异富集通路（C）T1与T3差异富集生物过程的基因本体分析（D）T1和T3免疫细胞浸润水平的差异（E）：TCGA数据库中免疫细胞浸润水平的差异。

讨论和启发

肺腺癌的NE转化是靶向治疗耐药的原因之一，在EGFR突变肺腺癌中有较多研究。针对EGFR突变肺腺癌NE转化的研究表明，TP53和RB1的基因变异组合可能是NE转化的特征性分子标志之一^[2]。根据既往ALK融合阳性肺腺癌NE转化的案例报道，4例接受TP53+RB1检测的患者中，仅有1例检出了TP53+RB1的基因变异组合^[3-6]。

在本病例中，也没有检出TP53+RB1的基因变异，但出现了与RB1处于同一通路的细胞周期相关基因的变异，包括CDK4拷贝数扩增和CDKN2A/CDKN2B拷贝数缺失，提示CDK4有可能成为NE转化的潜在治疗靶点。

此外，EGFR突变肺腺癌的SCLC转化中，AID/APOBEC相关突变过度激活^[2,7]，本病例中并没有看见类似的情况，但出现了MMR相关的突变特征增加。在基因表达方面，NE转化后细胞周期和DNA修复基因的表达上调，而同源重组和MMR信号通路基因的上调与SCLC的高增殖能力一致。

通常认为Notch通路的抑制是SCLC转化的先决条件^[8-9]，但本病例中转化后出现了Notch的显著激活，这可能是因为Notch信号在SCLC中既可抑制肿瘤又可促肿瘤，在转化过程中处于被抑制状态，在转化过程后期上调。此外，M2巨噬细胞作为肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制亚型，转化后出现显著富集，说明转化后的肿瘤微环境呈免疫抑制状态。

本研究通过病例的基因组和转录组测序系统性探索ALK融合阳性肺腺癌的NE转化机制，并提示ALK融合阳性肺腺癌的NE转化机制可能与EGFR突变肺腺癌的不同。

通讯作者杨衿记教授点评

通讯作者

杨衿记教授

主任医师，博士生导师，博士后合作导师

中共广东省人民医院纪委委员

肿瘤中心党总支书记

肿瘤中心主任

肿瘤学教研室主任

肿瘤中心肺一科主任

广东省医师协会肿瘤内科医师分会主任委员

中国临床肿瘤学会（CSCO）理事

杨衿记教授：ALK融合基因是继EGFR突变后发现的重要分子肺癌靶点，被称为“钻石突变”。ALK-TKI靶向治疗效果较好，但获得性耐药限制了其临床疗效，而NE转化是其TKI耐药的重要原因之一。

EGFR突变肺腺癌经TKI治疗后出现NE转化研究相对较多，而ALK融合阳性肺腺癌TKI治疗后的NE转化目前仅有一些案例报道，而本研究是第一个通过对转化前后样本的基因组和转录组测序，揭示NE转化分子机制的研究，具有重要的意义。

研究结果表明这一病例并没有出现EGFR突变肺腺癌NE转化常见的RB1/TP53基因变异组合，提示ALK融合阳性肺腺癌NE转化的机制有可能与EGFR突变肺腺癌不同。此外，研究发现转化后检测到细胞周期相关基因变异和通路激活，包括CDK4拷贝数扩增和CDKN2A/CDKN2B拷贝数缺失，提示CDK4/6抑制剂有可能作为潜在的治疗方案治疗因NE转化耐药的肺腺癌患者。

通过结合基因组和转录组测序的系统性研究，可以更加深入理解ALK融合阳性肺腺癌NE转化的分子机制，并为未来有效治疗因NE转化耐药的肺腺癌患者提供诊断和治疗依据。

作者简介

第一作者

黄婕博士

南方医科大学与美国MD Anderson Cancer Center联合培养博士

广东省人民医院肺癌研究所医生

致力于小细胞肺癌转化研究、免疫治疗耐药研究。研究成果发表于J Thorac Oncol、Mol Cancer等专业杂志。获得2018年CSCO“35 under 35”青年肿瘤医师风采比赛最具潜力青年肿瘤医师奖

共同作者

张仕灵硕士研究生

南方医科大学

广东省肺癌研究所

主要研究方向：

转化型小细胞肺癌治疗

参考文献：

1.Yue Pan et al. The Resistance Mechanisms and Treatment Strategies for ALK-Rearranged Non-Small Cell Lung Cancer. Front Oncol. 2021;11:713530

2.Offin M, Chan JM, Tenet M, et al. Concurrent RB1 and TP53 alterations define a subset of EGFR-mutant lung cancers at risk for histologic transformation and inferior clinical outcomes. J Thorac Oncol. 2019;14:1784–1793.

3.Coleman N et al. Transformation to neuroendocrine carcinoma as a resistance mechanism to lorlatinib. Lung Cancer. 2019;134:117–120.

4.Ou SI et al. Dual occurrence of ALK G1202R solvent front mutation and small cell lung cancer transformation as resistance mechanisms to second generation ALK inhibitors without prior exposure to crizotinib. Pitfall of solely relying on liquid re-biopsy? Lung Cancer. 2017;106:110–114.

5.Zhu YC et al. Patients harboring ALK rearrangement adenocarcinoma after acquired resistance to crizotinib and transformation to small-cell lung cancer: a case report. Onco Targets Ther. 2017;10:3187–3192.

6.Koyama K, Katsurada N, Jimbo N, et al. Overexpression of CD 133 and BCL-2 in non-small cell lung cancer with neuroendocrine differentiation after transformation in ALK rearrangement-positive adenocarcinoma. Pathol Int. 2019;69:294–299.

7.Lee JK et al. Clonal history and genetic predictors of transformation into small-cell carcinomas from lung adenocarcinomas. J Clin Oncol. 2017;35:3065–3074.

8.Quintanal-Villalonga A et al. Multi-omic analysis of lung tumors defines pathways activated in neuroendocrine transformation. Cancer Discov. 2021;11:3028–3047.

9.Sriuranpong V et al. Notch signaling induces cell cycle arrest in small cell lung cancer cells. Cancer Res. 2001;61:3200–3205

审校：Uni

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