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液体活检在肝癌中的潜在临床应用

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来源: 探癌

卢煜明院士最近在Journal of Hepatology上发表了一篇关于肝癌液体活检的综述,在该篇综述中讨论了液体活检中cfDNA的发展,生物学特征, 以及它们用于肝细胞癌检测、监测和管理的潜在临床应用等

背景

术语“液体活检”常用于指血浆和其他体液(如胸水、腹水和脑脊液)中循环无细胞DNA(cfDNA)的分析,但它也包括对血液中循环肿瘤细胞(CTCs)和其他核酸(如RNA和microRNA)的分析。血液中CTCs以非常低的浓度存在,通常每毫升血液少于10个CTCs,甚至在患有转移性疾病的患者中也是如此。每毫升血液中有大约1000万个有核细胞,换算下来就是一百万个有核血细胞中CTCs将少于1个。这种低浓度特征极大地限制了CTCs的诊断分析潜力。例如,Yu et al.表明在可手术的肝细胞癌(HCC)患者中,每7.5ml血液中平均只有1.15个CTCs。与每7.5 ml血液中<2个CTCs的患者相比,每7.5 ml血液中≥2个CTCs的患者其无病生存期和总生存期较低。与CTC相比,cfDNA由癌细胞贡献的比例显著更高。Cai et al.研究表明,在晚期HCC患者中,携带癌症特异性突变的DNA片段可占cfDNA的50%以上。也正因为cfDNA中源自肿瘤的DNA比例比有核血细胞中CTCs的比例高,使得cfDNA的分析比CTCs更广泛地应用于癌症的管理。

从早期癌症的筛查到晚期癌症患者的治疗指导,液体活检越来越多地用于癌症患者的管理。研究者也积极探索液体活检用于治疗肝癌的潜在应用,希望克服常规肿瘤标志物(主要是蛋白质或糖蛋白)的局限性。已在多种癌症患者的cfDNA中检测到癌症相关的突变,包括单核苷酸突变(SNVs)、拷贝数改变(CNAs)、甲基化改变和DNA片段化模式改变,其在HCC患者管理中具有潜在的临床应用(图1)。

图1. HCC管理中的液体活检概述

cfDNA分析的发展史

首次发现人体血液中细胞外核酸的存在可以追溯到1948年, 在随后的几十年中cfDNA分子的生物学特性和诊断应用在一直都在积极进行。Leon et al. 的研究表明癌症患者的cfDNA浓度高于健康人的浓度,这激励了研究人员研究cfDNA在肿瘤学中潜在的应用。随着PCR的技术的发展,在癌症患者的cfDNA中检测到肿瘤相关的基因突变和微卫星改变。1997年,受到癌症患者血液中存在肿瘤衍生的cfDNA启发,Lo et al. 发现cffDNA(cell-free foetal DNA)存在于孕妇的血浆和血清中。这一发现为基于cfDNA的NIPT发展铺平了道路。每年有数百万孕妇使用NIPT,这种基于cfDNA的胎儿染色体非整倍体无创产前检测改变了临床实践,是cfDNA技术的首次成功应用,并已在数十个国家推行。实际上,ctDNA(循环肿瘤DNA)和cffDNA(循环胎儿DNA)之间的多重相似性激发了肿瘤和产前这2个领域的许多类似发展。在这些发展的推动下,全球的研究者对在其他领域使用cfDNA进行液体活检的兴趣浓厚,特别癌症检测和监测领域。多种类型癌症相关分子实体(包括SNVs、CNAs、易位、甲基化学改变、基因表达改变和病毒DNA)已在无细胞核酸中检测。

cfDNA的生物学特征

有许多研究工作集中在cfDNA的生物学特征上。大多数cfDNA分子是小于200bp的短片段。Chan et al. 使用了一系列不同大小的扩增子进行PCR发现鼻咽癌患者中超过90%的ctDNA片段大小低于180bp。对cfDNA进行双端测序的研究发现,在健康个体以及不同疾病/生理条件(包括癌症、妊娠和自身免疫疾病)个体的cfDNA大小分布中,均观察到166bp的峰存在。源自于肿瘤的DNA片段长度比源自非恶性组织的DNA的短。源自于胎儿的cfDNA片段长度比源自孕妇本身的短。这些特征被认为与DNA的核小体包装和与组蛋白的相互作用有关。对这种碎裂模式的研究可称为“片段化组学”(fragmentomics)。

Snyder et al.推断核小体结构与基因表达之间存在关联,因此使用来自基因组不同部分的血浆DNA分子频率构建了全基因组核小体图谱。由于基因表达谱在不同的组织类型中存在差异,Snyder et al.能够使用其核小体图谱推断出不同组织对血浆中cfDNA的贡献,并表示这种方法可提供晚期癌症患者肿瘤的解剖学信息。例如,来自IV期HCC患者的血浆DNA核小体图谱显示出与HCC细胞系(HepG2)基因表达谱的最高相关性。Chan et al. 进一步报道了cfDNA的片段化是非随机的,并且有一些基因组区域在cfDNA末端存在富集的情况,并称这些cfDNA为“cfDNA偏好性末端”(cfDNA preferred ends),表明偏好性末端的基因组位置实际上反映了特定cfDNA片段起源于的核小体模式。如,具有胎盘DNA偏好性末端的cfDNA片段的比例与孕妇血浆DNA中的胎儿DNA的比例正相关。Jiang et al. 确定了一组偏好性末端位点,这些位点似乎优先与HCC相关,通过使用这些位点,可以增强检测血浆DNA中HCC相关突变的稳定性。这种新兴技术的原理如图2所示。

图2. 鉴定cfDNA末端特征的原理示意图

用于cfDNA分析品制备的策略

影响液体活检准确性的一个关键因素是由癌细胞贡献的cfDNA的比例。由于cfDNA的浓度远低于血细胞的数量,因此来自血细胞的DNA的污染将显著稀释血浆样品中的肿瘤衍生的DNA浓度,从而影响下游分析。两种方法可使cfDNA中来自血细胞DNA的污染最小化。(1)尽量减少血液采集和储存期间血细胞的溶解;避免采血期间的溶血,明显溶血的血液样品不适合cfDNA分析;血液样本应在收集后6小时内处理,以便从血细胞中分离出血浆,因为既往研究表明超过6小时延迟处理会导致血细胞释放大量DNA;在过去几年中,发展出专门用于cfDNA分析的血液采集管,这些血液采集管含有稳定血细胞的添加剂,使得血液中血细胞DNA的释放最短可达6天。(2)确保从血浆中彻底清除血细胞;通常采用双离心方案,即先将血液样品低速离心,分离血浆与血细胞;然后对收集的血浆高速离心,去除血浆中残留的血细胞。

液体活检在肝癌治疗中的临床应用

与cfDNA在HCC管理中的临床应用包括:诊断和筛查、风险预测、治疗指导,以及预后监测。

(1)诊断和筛查

HCC是全球第六大常见癌症,但却是癌症相关死亡的第二大原因。HCC预后不良的一个关键原因早期HCC相对无症状,大多数患者在确诊时已是癌症晚期。在这方面,液体活检可用于HCC的监测和诊断。Liao et al. 使用基于扩增子的测序来研究HCC患者中涵盖3个基因(TERT、CTNNB1和TP53)上的22个热点突变。研究对41例(其中38例为HBeAg阳性)HCC患者的血浆样本进行分析,19.5%(8例)的患者至少携带1个肿瘤相关突变;TERT、CTNNB1和TP53基因上热点区域的突变分别仅在3.9%、7.8%和3.9%的HCC患者中被发现,这表明通过扩大靶向区域来检测基因突变可以提高敏感性。然而,当扩大突变的分析范围时,有6个对照样本在这3个基因上至少携带1个突变。这些结果表明,如果想确定一位患者是否仅患有癌症,其检测方法的敏感性和特异性都会面临重大挑战。同时,大多数在克隆性造血过程中发生突变的个体在其一生中可能不会得癌症,与年龄相关的克隆性造血体系突变可能对cfDNA突变分析的特异性产生不利影响。

为了提高早期癌症检测整体的敏感性和特异性,Cohen et al.将基于UMI的突变检测和8种常规蛋白生物标志物(如CA125、CEA、癌抗原19-9、催乳素、肝细胞生长因子等)整合到风险评估测试CancerSEEK中。他们共分析了患有8种常见癌症的1,005名患者和812名健康对照者。8种常见癌症(卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌)的中位总敏感性为70%,特异性为99%;其中98%(43/44)的肝癌患者被检测到。与其他癌症类型相比,这些初步数据表明CancerSEEK在检测肝癌方面表现更好。在慢性乙型肝炎携带者和肝硬化患者中验证该检测的特异性非常重要,因为大多数(70%~80%)HCC患者与乙型肝炎感染有因果关系。

Chan et al.使用全基因组测序表明可在cfDNA和配对的肿瘤组织中检测到一致的拷贝数变异和突变。该观察结果表明,由源自肿瘤的突变可用于监测患者的临床进展和治疗后残留病灶的检测。在一项随访研究中,研究者发现84.4%(76/90)的HCC患者在其血浆中1号和/或8 号染色体存在CNAs。这些CNAs的检出率在有和没有肝硬化的乙型肝炎携带者中分别为22.2%和4.5%。2名检出CNA的肝炎患者,在采血时HCC状态未知,但在3~4个月后被诊断为HCC,这表明CNA分析可能对HCC的监测或筛查有用。

Wong et al.等使用甲基化特异性PCR表明在HCC患者血液中容易检测到CDKN2A(编码p16)和CDKN2B(编码p15)甲基化异常。RASSF1A高甲基化分析对HCC患者检测具有70~93%的敏感性。cfDNA分子中异常的甲基化信号使得能够检测AFP阴性的HCC。最近,研究显示通过更多的甲基化标志物可以提高诊断准确性。Xu et al.在383个HCC和275个正常样本的队列中对1,000个标志物进行分析发现其灵敏度达到83.3%,特异性达到90.5%。Chan et al. 将全基因组低甲基化与CNA相结合,区分可进行手术的HCC患者和慢性乙型肝炎携带者的敏感性为92%,特异性为88%。

目前可使用诸如蛋白质标志物和各种成像方式对肿瘤进行溯源。但探索“血浆DNA组织定位”(plasma DNA tissue mapping)——使用cfDNA进行肿瘤的组织溯源有利于将来的研究。对全基因组甲基化组学分析血浆DNA组织定位可用作“全身分子成像”的方法,用于鉴定在cfDNA中检测到的突变的潜在组织起源(图3)。

图3. 血浆DNA的甲基化分析

血浆DNA由源自不同组织/器官中细胞死亡和细胞凋亡过程中产生DNA分子组成。组织特异性甲基化特征或癌症相关甲基化变化可以反映在癌症患者的血浆DNA中。经亚硫酸氢盐处理后,原 DNA 样本中的胞嘧啶 (C) 可转化为尿嘧啶 (U),而 5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶的几率极低,所以,亚硫酸氢钠处理后再进行PCR的产物中,胞嘧啶只来自于 5-甲基胞嘧啶。这种方式可有效保留DNA的甲基化信息,被广泛使用于特定位点和全基因组的甲基化检测。

(2)HCC的风险预测

在cfDNA中可以检测到在HCC早期阶段发生的癌前基因和表观遗传改变。Wu et al. 分析了237例HCC患者及其相匹配的cfDNA 样本中6个基因(CDKN2A、RASSF1A、STEAP4、TBX2、VIM和ZNF154)的甲基化水平,发现cfDNA中TBX甲基化的存在与未来HCC发生的风险增加相关,其OR=5.35 。除了cfDNA外,Huang et al.鉴定了一组由16种miRNAs组成的miRNA特征,这组miRNAs可以预测慢性丙型肝炎携带者发生HCC的风险。

(3)指导治疗决策

cfDNA分析的一个重要应用是指导治疗决策,特别是在靶向治疗这块。例如,使用液体活检分析EGFR突变已被广泛应用于指导EGFR-TKIs的使用。许多研究已证明可以在HCC患者的cfDNA中使用靶向大规模平行测序鉴定癌症相关的驱动突变。进一步研究显示cfDNA的突变特征反映了相应肿瘤组织中的状态。目前,对HCC患者的基因突变分析不是指导治疗决策的常规方法,其原因有两个:(1)只有7种批准用于HCC全身治疗的药物(包括作为晚期HCC一线治疗的sorafenib 和lenvatinib;作为疾病进展的HCC患者二线治疗的regorafenib、cabozantinib、ramucirumab、nivolumab和pembrolizumab);(2)sorafenib 和lenvatinib的治疗反应与特定基因突变无关。

当然也不能低估cfDNA突变分析用于HCC管理的潜力。大多数HCC靶向治疗临床试验未能证明结果的显著性或满足其主要终点的一个关键原因是HCC患者在病因学和分子病理机制方面的异质性。液体活检为晚期HCC患者的突变谱的大规模评估提供了一种非侵入性方法。这可用于鉴定对治疗药物有反应的患者亚组以及更可能发生严重药物不良反应的患者亚组。

近期研究已经显示在多种实体瘤中TMB能够预测患者对免疫疗法的临床反应。基于cfDNA的TMB检测可用于预测非小细胞肺癌患者对PD-L1免疫抑制剂atezolizumab的治疗反应,无论PD-L1表达如何。基于cfDNA的TMB是否有助于预测HCC患者对免疫治疗的反应是值得探讨的问题。

(4)预后监测

癌症衍生的CNAs、突变和甲基化改变可用于监测HCC治疗后的疾病进展。在一项涉及4名患者的概念验证研究中,Cai et al.对手术切除的HCC肿瘤组织样本进行了574个癌症相关基因的测序,并鉴定了204~253个突变,且发现使用捕获测序,相应患者的cfDNA中可检测到超过98%的这些突变,并且这些突变的丰度与患者的临床状态呈正相关。Garcia-Fernandez et al. 研究还表明,在肝移植治疗HCC患者cfDNA中检测到的p53突变与肿瘤复发相关。

在Xu et al.研究中,基于10个甲基化标记的cfDNA甲基化评分从HCC I期到IV期逐渐增加,并且在肿瘤切除后下降。与临床缓解患者相比,在疾病进展的患者中观察到明显更高的评分,表明该方法可潜在地用于监测患者进展和残留病灶检测。

总结

在HCC患者的cfDNA中越来越多地报道存在与癌症相关的突变,包括单核苷酸突变、CNAs和甲基化异常。最初的探索性研究报道,使用多种标志物或基因和表观遗传方法的组合可以实现检测HCC的合理灵敏度和特异性。由于大多数现有研究报道都是回顾性病例对照研究,因此一个重要的考虑因素是对照的选择。在HCC发病率高的地区,例如东南亚,风险群体是那些患有慢性乙型肝炎/丙型肝炎感染和/或肝硬化的人群。因此,这些试验在慢性肝炎和/或肝硬化患者中的特异性是最相关的。此外,需要进一步评估这些测试的应用是否可以改善临床结果。最近,一项关于鼻咽癌筛查的大规模前瞻性试验表明,cfDNA分析可用于鉴别早期无症状癌症,从而提高生存率。这类研究有助于确定液体活检在HCC监测中的作用。由于HCC是一种相对异质性的疾病,具有多种病因和致癌驱动事件,使用cfDNA突变进行分析也可更好地表征患者,这对于优化患者的治疗和评估药物试验中不同治疗选择的疗效具有重要作用。

参考文献

NCCN临床实践指南:肝胆肿瘤(2019.V2).

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